黃金時(shí)代的發(fā)現

　　20世紀80年代末與90年代初，伴隨著(zhù)多聚酶鏈式反應(PCR)技術(shù)的出現，分子生物學(xué)進(jìn)入黃金時(shí)代。而在此之前，高效率擴增DNA序列是不可能的。PCR的出現讓基因的克隆進(jìn)入井噴時(shí)期。1991年，美國哥倫比亞大學(xué)的Axel教授與Buck博士利用PCR方法發(fā)現了龐大的嗅覺(jué)受體基因家族，并于十多年后因此一起獲得諾貝爾醫學(xué)與生理學(xué)獎。1992年，在美國德克薩斯大學(xué)西南醫學(xué)研究中心，年僅36歲的Tom Sudhof博士已經(jīng)擁有了自己的實(shí)驗室，成為助理教授。他是一位生物化學(xué)家，但是卻對神經(jīng)科學(xué)非常感興趣，他決心用自己學(xué)到的生物化學(xué)和最新的分子生物學(xué)方法來(lái)研究復雜的大腦。怎么入手呢？

　　故事要從突觸說(shuō)起。我們大腦中的主要細胞——神經(jīng)元是如何相互通訊的呢？1897年英國神經(jīng)生理學(xué)家Sherrington提出了“突觸”的概念。他通過(guò)當時(shí)非常有限的神經(jīng)生理學(xué)知識，創(chuàng )造性地提出：神經(jīng)元之間通過(guò)一種叫作突觸的結構來(lái)相互通訊，而并非直接連通(圖1)。至于突觸有什么特性，怎么組成，這些問(wèn)題是一百多年后通過(guò)分子生物學(xué)的手段來(lái)解決的。

　　【圖1 突觸(李葉菲 圖)】

　　年輕的Sudhof博士雄心勃勃地要用生物化學(xué)的方法來(lái)解開(kāi)突觸的奧秘。當時(shí)已經(jīng)知道突觸是細胞膜的脂雙層結構，上面有一些神經(jīng)遞質(zhì)受體，但是突觸之所以能夠形成，仿佛不是神經(jīng)遞質(zhì)受體的作用，因為神經(jīng)遞質(zhì)傳導通常發(fā)生在神經(jīng)元的突觸連接建立完成的時(shí)刻，那么究竟是什么信號誘導了突觸連接的形成呢？Sudhof博士認為，一定是突觸上面有一些跨膜的蛋白質(zhì)，介導了前一個(gè)神經(jīng)元與后一個(gè)神經(jīng)元形成突觸，然后突觸傳導才能夠發(fā)生。

　　怎樣找到這些微小突觸上的跨膜蛋白呢？他們使用了一種非常巧妙的方法，借助黑寡婦毒蜘蛛的力量。毒理學(xué)家們從黑寡婦毒蜘蛛的毒液中分離出一種蛛毒素(latrotoxin)，并應用電生理學(xué)的方法知道蛛毒素可以非常強烈地誘導突觸的遞質(zhì)發(fā)放而使生物體的神經(jīng)末梢癱瘓，這就是毒蜘蛛致命毒液的奧秘。

　　Sudhof博士想，蛛毒素本身是一種蛋白質(zhì)，它之所以能夠誘導突觸的遞質(zhì)發(fā)放，是否是蛛毒素作用在了突觸上的某種蛋白質(zhì)上而產(chǎn)生的效應呢？應用高超的生物化學(xué)技術(shù)，Sudhof博士用蛛毒素蛋白做親和層析的誘餌，在大腦樣本中純化到了很多與蛛毒素蛋白相互作用的蛋白，接著(zhù)對這些肽段進(jìn)行分析以后得到可能的DNA編碼序列，應用簡(jiǎn)并探針進(jìn)行PCR的擴增，從基因文庫中擴增到了一個(gè)神奇的基因，這個(gè)基因編碼的跨膜蛋白質(zhì)位于神經(jīng)突觸的突觸前部分，確實(shí)與突觸遞質(zhì)釋放關(guān)系密切。Sudhof博士給這個(gè)蛋白起了一個(gè)很文藝的名字—Neurexin，不知后綴-xin是否是為了紀念蛛毒素的功績(jì)[1]。

　　在發(fā)現了Neurexin后，Sudhof博士越戰越勇，繼續用Neurexin作為誘餌，用生物化學(xué)的方法發(fā)現了Neurexin蛋白在突觸后的配體——neuroligin[2]。從此神經(jīng)突觸最重要的粘聯(lián)蛋白家族終于揭開(kāi)了神秘的面紗。這個(gè)neurexin-neuroligin家族擁有眾多的家族成員，結構復雜功能重要，引無(wú)數生物學(xué)家競折腰。

　　筆者原以為Sudhof博士會(huì )因為發(fā)現了這個(gè)神秘突觸粘聯(lián)蛋白家族而獲得諾貝爾獎，沒(méi)想到Sudhof博士卻因為另外一個(gè)重要發(fā)現“突觸前的囊泡轉運蛋白”剛剛在今年獲得了諾貝爾醫學(xué)與生理學(xué)獎。造化弄人，Sudhof博士在接到斯德哥爾摩的電話(huà)時(shí)的第一反應居然是，“你不是開(kāi)玩笑吧！”享受諾貝爾獎榮光的同時(shí)，我們期待Sudhof博士會(huì )繼續20年前發(fā)現neurexin-neuroligin的傳奇。

　　突觸與自閉癥

　　在發(fā)現了neurexin-neuroligin家族之后，Sudhof博士的團隊很快發(fā)現位于突觸后結構的neuroligin蛋白與突觸后的骨架蛋白PSD95有非常強的相互作用[3]。那么neurexin與neuroligin蛋白家族究竟與突觸的形成有什么關(guān)系呢？這時(shí)在美國哥倫比亞大學(xué)的Scheiffele博士實(shí)驗室與華盛頓大學(xué)的Craig博士實(shí)驗室發(fā)表了一系列里程碑式的文章，證明neurexin與neuroligin家族確實(shí)對于突觸的形成有非常重要的作用(圖2)[4-6]。

　　【圖2 neurexin-neuroligin 在突觸中的重要功能(李葉菲 圖)】

　　在神經(jīng)生物學(xué)家正在為揭開(kāi)neurexin-neuroligin家族的神秘面紗如癡如醉的時(shí)候，一篇法國科學(xué)家發(fā)表在《自然- 遺傳學(xué)》上的論文一下子讓neuroligin家族成為自閉癥研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)[7]。法國的遺傳學(xué)家們在對多個(gè)患有自閉癥的家系進(jìn)行基因測序的分析中，意外地發(fā)現位于X染色體上的neuroligin3與neuroligin4基因在自閉癥病人中都發(fā)生了突變。同一個(gè)研究組于2007年又發(fā)現另外一種突觸中的重要骨架蛋白編碼基因Shank3的突變也與自閉癥緊密相關(guān)[8]。自閉癥這種復雜的神經(jīng)系統疾病難道是突觸的功能發(fā)生異常而導致的么？

　　讓我們簡(jiǎn)單聊聊自閉癥的疾病特點(diǎn)，Kanner醫生在1946年發(fā)表在《美國精神病學(xué)》期刊上的一篇論文，第一次描述了“自閉癥”這種疾病[9]。Kanner醫生發(fā)現有一類(lèi)小朋友，具備一些獨特的行為特征：不喜歡與外界交流，通常自己玩耍，反復地做同樣的一些事情或同樣的動(dòng)作，而且常常有語(yǔ)言障礙，無(wú)法正常表達自己的想法或者只能說(shuō)一些簡(jiǎn)單的音節與詞語(yǔ)。

　　因此我們可以將自閉癥的癥狀歸為3個(gè)重要方面：交流溝通缺陷、重復刻板行為與語(yǔ)言發(fā)育缺陷。自閉癥的癥狀有輕重之分，嚴重的自閉癥病人完全無(wú)法與人交流，而且往往因為無(wú)法經(jīng)過(guò)足夠的教育得到改善而很難融入到社會(huì )中去。在意外死亡的自閉癥病人的大腦中進(jìn)行的解剖研究也沒(méi)有發(fā)現自閉癥病人的大腦中有任何病變，既不像阿爾茲海默病人中有淀粉樣沉積和病變，也不像帕金森病人那樣缺失某一類(lèi)神經(jīng)元比如多巴胺能神經(jīng)元，等等。

　　因此，對于自閉癥的研究在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)興起之前，一直停留在假說(shuō)與猜想階段，有些科學(xué)家認為自閉癥與遺傳因素有關(guān)，因為雙生子中一個(gè)出現自閉癥，另外一個(gè)出現自閉癥的幾率大大增加。但是還有一些科學(xué)家認為自閉癥完全是后天的外界因素導致的，甚至與孕期的過(guò)敏或母親的免疫失調有關(guān)。必須指出的是，這些猜想都沒(méi)有足夠的實(shí)驗證據加以支持。而20世紀90年代分子生物學(xué)手段的興起，加上人類(lèi)基因組計劃的開(kāi)展，使得對疾病的基因突變研究大大加快。

　　經(jīng)過(guò)對大量自閉癥病人的遺傳篩選，科學(xué)家們已經(jīng)可以基本確認自閉癥與遺傳因素關(guān)系最為密切，有一系列重要基因被發(fā)現在自閉癥病人中發(fā)生了突變，例如neuroligin、neurexin、shank3等等，而很多在自閉癥病人中發(fā)生了突變的基因，都是與突觸功能密切相關(guān)的。因此，對于自閉癥的神經(jīng)生物學(xué)研究，必須緊緊圍繞著(zhù)突觸展開(kāi)。因此，當我們回頭看為什么自閉癥病人大腦中沒(méi)有出現明顯的病變的時(shí)候，也就會(huì )明白，與老年癡呆癥或帕金森癥此類(lèi)由神經(jīng)元的病變、死亡導致的疾病不同，自閉癥是一種神經(jīng)突觸功能異常導致的疾病。當我們明白了這點(diǎn)之后，就可能對這些異常來(lái)針對性地設計藥物，對自閉癥進(jìn)行針對性的治療。

　　自閉癥的動(dòng)物模型研究

　　通過(guò)對自閉癥進(jìn)行近十年的遺傳學(xué)研究，遺傳學(xué)家發(fā)現自閉癥并非單一基因致病，有很多基因都被發(fā)現在自閉癥病人的基因組中發(fā)生了突變，但是并沒(méi)有一種或幾種基因占主導地位(圖3)。科學(xué)家們于是想，這些在自閉癥病人中發(fā)生了突變的幾十種甚至上百種基因，它們之間是否有內在的聯(lián)系呢？經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)的分析，科學(xué)家們已經(jīng)陸續發(fā)現了自閉癥致病基因之間確實(shí)有一些內在聯(lián)系，從而解釋了為什么不同的基因突變會(huì )導致同一種疾病[10]。

　　【圖3 自閉癥病人遺傳因素圖(李葉菲 圖)】

　　但是，一個(gè)非常重要的問(wèn)題還沒(méi)有回答，這些在自閉癥病人中發(fā)現突變的基因，它們是否真的是導致自閉癥的罪魁禍首呢？雖然這些基因突變導致重要蛋白質(zhì)的結構與功能改變，但是因為它們大多出現散發(fā)的狀態(tài)，就是說(shuō)一個(gè)自閉癥病人基因組中找到的突變往往極少可能會(huì )在另外一個(gè)自閉癥病人的基因組里找到。因此，從統計學(xué)及遺傳學(xué)上，我們無(wú)法知道這些基因突變究竟是否致病，我們需要利用生物學(xué)的方法來(lái)予以確認。

　　2007年，已經(jīng)功成名就，成為美國國家科學(xué)院院士的Sudhof博士又做了一個(gè)重要的工作——利用現代神經(jīng)生物學(xué)的手段證明了neuroligin家族之一的neuroligin3基因突變確實(shí)是導致自閉癥的原因[11]。

　　遺傳學(xué)家在對自閉癥病人的遺傳篩選中發(fā)現了neuroligin家族之一的neuroligin3基因在一些自閉癥病人的基因組中會(huì )發(fā)生突變，這個(gè)突變僅僅會(huì )改變一個(gè)氨基酸，將451的精氨酸變成了半胱氨酸(R451C)。那么被點(diǎn)突變改變的neuroligin3基因編碼的蛋白會(huì )不會(huì )是導致自閉癥的罪魁禍首呢？Sudhof博士的團隊做了一系列精湛的工作，利用小鼠遺傳學(xué)的方法， 將小鼠基因組上面的neuroligin3基因也做了對應的突變。于是這個(gè)小鼠就攜帶與人類(lèi)同樣的R451C突變。攜帶這個(gè)突變基因的小鼠，是否會(huì )像人類(lèi)自閉癥病人一樣出現這些類(lèi)似人類(lèi)疾病的異常呢？科學(xué)家們用一些行為學(xué)研究方法，對這些攜帶突變的小鼠與正常小鼠進(jìn)行比較，例如，將小鼠置于一個(gè)可以自由運動(dòng)的三廂，將被實(shí)驗鼠置于中間，左廂放著(zhù)一個(gè)玩具，右廂放一個(gè)同伴小鼠。

　　正常的小鼠通常會(huì )表現出更喜歡與同伴小鼠待在一起打打鬧鬧，而非與玩具玩耍，但是攜帶了neuroligin3 R451C突變的小鼠則沒(méi)有對同伴小鼠表現出更多的興趣，表現出對同伴與玩具“一視同仁”。這表示攜帶突變的小鼠沒(méi)有像正常小鼠一樣的社會(huì )交往行為。科學(xué)家們繼續在突變小鼠的神經(jīng)元中發(fā)現了異常，他們發(fā)現這種neuroligin3 R451C突變非常特異性地影響了神經(jīng)元之間的抑制性突觸連接，而造成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò )發(fā)生功能紊亂。這個(gè)里程碑式的工作除了證明突觸異常很有可能是導致自閉癥的原因以外，還指明了針對相應的突觸異常來(lái)設計藥物來(lái)治療自閉癥的新方向。

　　自閉癥的科學(xué)研究：昨天、今天和明天

　　自閉癥是一種非常復雜的疾病，是人類(lèi)社會(huì )的巨大挑戰。迄今為止，還沒(méi)有哪種疾病影響如此之廣，而又難找出病因。自閉癥與神經(jīng)系統功能的密切相關(guān)也常常令人浮想聯(lián)翩，我們的社會(huì )交往行為、性格、個(gè)性，甚至思想等等，是否，或者在多大程度上由我們的基因決定？

　　以前對于自閉癥的研究?jì)H僅只能局限于假說(shuō)與理論推導，現代生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)可以讓我們進(jìn)行大規模的基因組測序來(lái)找到可能的致病基因致病突變，然后利用現代生物學(xué)的手段研究發(fā)生了突變的基因怎樣影響神經(jīng)系統的功能，甚至按照人類(lèi)的突變去制造動(dòng)物模型來(lái)研究基因突變致病機制，同時(shí)，也推動(dòng)了治療方法平臺的創(chuàng )立。今后，對于復雜疾病的研究必將涉及多種生物學(xué)、醫學(xué)及工程學(xué)手段。研究每一種復雜疾病的同時(shí)也為人類(lèi)了解自身提供了一把難得的鑰匙。尤其是對自閉癥這種神秘疾病的探索，面對著(zhù)一無(wú)所知的黑暗地帶，我們不能瞻前顧后而應不為未知所懼，奮勇前進(jìn)，在攻克一個(gè)又一個(gè)未知的科學(xué)堡壘的同時(shí)造福大眾，為促進(jìn)大眾健康盡到自己的一份力量。